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bigwig归一化方式详解
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欢迎关注”生信修炼手册”! 在chip_seq数据展示时，经常会用到bigwig文件，导入igvtools等基因组浏览器中，产生如下所示的图片  我们将IP样本相对Input样本中reads富集的区域定义为peak, 反映到上图中，则对应的为IP样本中reads出现了峰值，比如下图红色标记的区域  通过这种可视化的方式，可以直观的反映出peak区域的情况，但是在实际使用中需要注意归一化的问题。 bigwig文件本质上展示的是测序深度的分布信息，而原始的测序深度是和测序的reads量呈正相关关系的，比如Input样本测序5G, IP样本测序10G, 在原始的测序深度看，会看到Input样本相比IP样本，其测序深度是偏高的。当然这个是一个极端的例子，但是很好的说明了测序量的差异对原始的测序深度会有直接的影响。 为了消除样本间测序数据量差异的影响，很当然的我们想到了归一化，类似转录组中的定量策略，原始的测序深度就是raw count, 那么当然类似RPKM, CPM等归一化方式，对于bigwig文件而言，同样适用。 在deeptools中，提供了多种归一化方式 1. RPKMRPKM的公式如下 代码语言：javascript复制RPKM (per bin) = number of reads per bin / (number of mapped reads (in millions) * bin length (kb))用法如下 代码语言：javascript复制deeptools bamCoverage \ -p 10 \ --bam input.bam \ --normalizeUsing RPKM \ --outFileName rpkm.bigwig2. CPMCPM的公式如下 代码语言：javascript复制CPM (per bin) = number of reads per bin / number of mapped reads (in millions)用法如下 代码语言：javascript复制deeptools bamCoverage \ -p 10 \ --bam input.bam \ --normalizeUsing CPM \ --outFileName cpm.bigwig3. BPMBPM的公式如下 代码语言：javascript复制BPM (per bin) = number of reads per bin / sum of all reads per bin (in millions)用法如下 代码语言：javascript复制deeptools bamCoverage \ -p 10 \ --bam input.bam \ --normalizeUsing BPM \ --outFileName bpm.bigwig4. RPGCRPGC的公式如下 代码语言：javascript复制RPGC (per bin) = number of reads per bin / scaling factor for 1x average coverage scaling factor = (total number of mapped reads * fragment length) / effective genome size用法如下 代码语言：javascript复制deeptools bamCoverage \ -p 10 \ --bam input.bam \ --normalizeUsing RPGC \ --effectiveGenomeSize 2864785220 \ --outFileName rpgc.bigwig对于同一个样本而言，导入igvtools中，几种归一化方式产生的bigwig文件和原始的bigwig文件的峰形是完全一样的 ，示意如下  注意红色方框标记的纵轴的范围，可以看到不同方式，其纵轴范围不一样。 归一化主要用于样本间的比较， 比如在比较Input和Ip两个样本时，就应该使用归一化之后的数据，以RPKM为例，导入之后可以看到如下所示的结果  可以看到纵轴的范围是不一致的，为了更好的比较样本间的差异，我们需要把二者的纵轴范围调整成一致的，因为数据已经做了归一化处理，所以可以直接在同一范围内进行比较，设置成同一范围后，效果如下  对于上述多种归一化方式，其实都是可以拿来在样本间比较的。在实际操作中，由于RPKM的概念最为经典，应用的也最为广泛。 ·end· —如果喜欢，快分享给你的朋友们吧— 扫描关注微信号，更多精彩内容等着你！ |
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